【全球热闻】lncrna引物设计 lncRNA的套路分析

lncrna引物设计 lncRNA的套路分析

摘要

(资料图片)

非编码RNA (ncRNA) 参与表观遗传调控，但了解甚少。在这里，我们在11个解剖部位以5个碱基对分辨率描述了4个人类HOX基因座的转录景观特征，并鉴定出231个HOX ncRNAs, 它们将已知的转录区域延伸超过 30 千碱基。HOX ncRNAs沿发育轴空间表达，拥有独特的序列模体，其表达界定了差异组蛋白甲基化和RNA聚合酶可及性的广泛染色体结构域。

研究结果

图1

图1：HOXA位点的人类HOX转录组。

(A) 位点特异性转录。左：50532个探针的杂交强度，这些探针对11个样本中的每个样本的人 HOXA基因座进行拼接用圆圈编号。每个探针的强度显示为单个探针强度的比值除以阵列上所有301,027个探针的平均强度的log2每个探针的 log2比率取100 bp窗口的平均值；红色和绿色条分别表示高于或低于阵列平均值。蛋白编码HOX基因的基因组位置显示为棕色框。右：11 个成纤维细胞样本关于发育轴的解剖学来源。

(B) 转录区域通过瓷砖阵列上的连续信号识别，然后与 Refseq 序列比较以确定基因 [外显子粉色和内含子蓝色] 和基因间转录区域紫色。每个预测的HOX外显子或内含子分别被命名为HOXn或int-HOXn。基因间转录区域命名为 nchoxn，其中n是HOX编码链上位于ncRNA 3′ 端的 HOX paralog。

图2

图2：HOX ncRNA的位点特异性表达和一级序列模体。

(A) HOX编码的转录本沿着近端-远端轴差异表达。60个转录区域 12个HOX基因和48 个 ncRNA在远端成纤维细胞样本足部、手指、包皮和前列腺和所有其他细胞之间差异表达 P < 0.05，Student t 检验。以色阶表示高于或低于总体中位数的每个转录区域的表达水平线性刻度上为3倍至0.3倍，或log2刻度上为 + 1.6 至-1.6 倍。转录区域按其沿染色体的位置排序，样本通过这60个转录本的表达相似性进行分层聚类。HOX的旁系同源基因进化起源到飞翔超胸 (UBX) 或触角腹 (Antp) 分别用蓝色和黄色方框表示。

(B)HOX编码的转录本沿着前后解剖分区差异表达。总共有92个转录本 6 个 HOX 基因，86 个 ncRNA在前或后原代成纤维细胞培养脐上或脐下中差异表达 P < 0.05，Student t 检验。每个 ncRNA 的表达如 (a) 所示。

(C) 基于其表达模式，HOX ncRNA中富集的序列基序 (p < 10-9)。ncRNAs 一级序列中富集的序列基序的Logograms超过非转录的HOX序列，或者在ncRNAs的远端，近端，或后面的表达模式。在前部解剖部位表达的ncRNA没有比预期更多的一级序列模体。

图3

图3：在HOXA基因座占据Suz12,H3K27me3, 和pol II与在原代肺上或足下成纤维细胞 (Fb) 的 HOXA 基因座的 ~100 kb 转录活性上完全相反的染色质修饰和转录可达性。对于芯片数据，芯片/输入的 log2 比绘制在 Y 轴上。对于 RNA 数据，以线性比例显示杂交强度。虚线突出显示染色质修饰和基因间转录相反构型的边界。

图4

图4：HOXC位点反义基因间长ncRNA HOTAIR。

(A) HOTAIR在两个染色质结构域边界的基因组位置。芯片和RNA在拼接阵列上的表达如图 3 所示。

(B)链特异性RT-PCR显示HOXC基因相反链的 HOTAIR的唯一表达底部。设计逆转录 (P-RT)和PCR(P-PCR) 的引物，专门针对HOTAIR 的顶端引物F1-F3或底部链引物R1。

(C)肺和包皮成纤维细胞RNA中热空气的 Northern印迹分析。

(D) 大小片段小RNA用包含HOTAIR寡核苷酸池 1-3组，全长反义HOTAIR 或 miRNA let7a 探针探测。

(E) 用qrtpcr 检测HOTAIR在人纤维母细胞的后部和远端表达。每份成纤维细胞样本的来源部位由解剖卡通上的样本编号表示。“A”来源于头皮。每个位置相对于头皮最前面的热风相对丰度显示在 X 轴上。

(F) 在胚胎10.5天全胚胎上图和后肢及尾部左下图和右下图中使用HOTAIR sense 底链或antest 顶链探针进行全胚胎原位杂交。HOTAIR在后肢箭头和尾部箭头的表达突出显示。

图5

图5：HOXD位点H3K27三甲基化和Suz12占位需要 HOTAIR。

(A) HOXD基因座上H3K27me3 ChIP-ChIP信号的变化是由HOTAIR的耗竭引起的，与针对GFP 的对照siRNA相比。HOXD基因的位置用棕色框表示。

(B) 靶向GFP或HOTAIR的siRNA处理后，H3K27me3的ChIP和HOXD位点选择性启动子的 Suz12。底部：ChIP检测定量平均值标准误差。

结论

我们在HOXC基因座中发现了一个2.2千碱基的ncRNA，称为 HOTAIR，它通过 HOXD 基因座的40千碱基抑制转录。HOTAIR与多梳抑制复合体2 (PRC2) 相互作用，是PRC2占位和HOXD 位点组蛋白H3赖氨酸-27三甲基化所必需的。因此，ncRNA的转录可能在一定距离内界定了基因沉默的染色体区域；这些结果对发育和疾病状态下的基因调控具有广泛的意义。

DOI：10.1016/j.cell.2007.05.022

参考文献

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关键词：

责任编辑：Rex_16

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